低偏差扩增建库

采用二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）进行微生物多样性研究，文库制备至关重要。在高通量测序过程中，文库构建需要PCR扩增对原始样本序列进行指数放大，而在此过程中产生的差异也是必不可免的，他决定了样本中微量或是痕量微生物是否被检测，测序结果是否能真实地反应样本中微生物的存在情况。较传统PCR扩增不同，微基生物采用顶级期刊science发表的文章中低偏差扩增测序（Low Error Amplicon Sequencing，LEA-Seq）方法，这种建库方法更真实的反应环境中微生物的存在。

LEA-Seq扩增原理：特异引物融合测序引物和二代测序仪器所必须的adaptor后是一条长度将近100bp的引物，引物过长PCR扩增效果会相对降低。所以LEA-Seq方法是将引物设计成两条相对较短的引物，分别包括正向内侧引物，正向外侧引物，反向内侧引物，反向外侧引物。首先利用低浓度的正向内侧引物，对目的片段进行少数循环的线性扩增，随后加入正向外侧引物、反向内侧引物及反向外侧引物进行目的片的指数扩增，详细描述可参见参考文献。

参考文献：The Long-Term Stability of the Human Gut Microbiota. Science