特定微生物菌株及菌群的qPCR定量检测中首选探针法

实时聚合酶链式反应(PCR)是基于PCR的革命性方法。依赖于目标序列的高度特异性和高效扩增，以及荧光报告分子的加入，从而能够实时定量PCR产物。

特定微生物菌株及菌群的qPCR定量检测，对目标序列高效且特异性的扩增要求更高。探针法qPCR要达到检测的目的，不仅要上下游引物要跟模板匹配，还需要探针与模板匹配，提升了检测的特异性。对于模板同源性比较高的不同目的基因的检测和鉴定，在扩增引物特异性没法保证的情况下，可通过设计探针的特异性来达到特异性检测的目的。微基生物推荐使用具有目标特异性的荧光探针TaqMan方法。

以下是qPCR定量分析检测中常用的两个方法，嵌合荧光染料法SYBR Green和荧光探针法TaqMan简单解读：

嵌合荧光染料和基于水解的荧光探针检测的原理比较

 

文献：A beginner’s guide to RT-PCR, qPCR and RT-qPCR

A.SYBR®Green 检测：cDNA变性后，引物退火并延伸。在延伸过程中，SYBR Green与双链DNA(dsDNA) 结合，发出荧光信号，可被qPCR仪器检测到。

B.TaqMan®探针检测：TaqMan 探针将引物下游与单链cDNA结合。在延伸过程中，聚合酶会分解探针，由于失去与淬灭剂部分的接近度，从而可以检测到荧光信号。

引物可以在扩增反应中与DNA结合染料结合使用，以监测双链DNA(dsDNA)的出现。荧光标记的探针可用于在qPCR测定中获得更高的特异性。

示例解读：鹅源星状病毒TaqMan探针和SYBR Green I染料法荧光定量PCR检测方法的建立及其应用比较（2022）

探针法和染料法荧光定量PCR的比较

以倍比稀释的标准品质粒作为模板，对本试验建立并优化的2种荧光定量PCR检测方法进行特异性、敏感性和重复性的验证及比较。

 

特异性试验

结果显示：2种荧光定量PCR方法均仅对GoAstV有特异性扩增，其他病原及阴性对照均无特异性扩增，特异性良好。

 

敏感性试验

结果显示：本试验建立的TaqMan和SYBR Green I荧光定量PCR方法分别比普通RT－PCR方法的灵敏度高100倍和10倍；TaqMan法比SYBR Green I染料法灵敏度高10倍，说明TaqMan探针法荧光定量PCR方法的灵敏性更高。

 

重复性实验

结果显示：TaqMan荧光定量PCR方法的组内变异系数和组间变异系数均小于 SYBR Green I荧光定量PCR的组内变异系数和组间变异系数，说明TaqMan荧光定量PCR方法重复性更好，更加稳定。

 

临床样品检测

临床上71份样品进行检测，TaqMan荧光定量PCR方法检测出阳性35例，检出率为49.3%；SYBR Green I荧光定量PCR方法检测出阳性30例，检出率为42.25%；普通RT－PCR方法检测出阳性21例，检出率为29.58%。结果显示TaqMan荧光定量PCR方法的检出率最高，与敏感性试验结果相一致。

 

对于特定微生物菌株及菌群的qPCR定量检测微基生物推荐使用探针法，如您有实验需求，欢迎联系我们: 400-660-9270，我们将竭诚帮助您达成实验目标。