实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

原理
　　在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累计实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
特点
　　检测仪器少，只用一台仪器。
　　检测时间短，只须45分钟～1小时10分钟（试剂各异），而定性PCR须3～4小时，酶免终点定量须6～8小时，荧光终点定量须2～3小时。
　　操作极其简单：前处理后，样本插入仪器一小时后到电脑上来出报告即可，无须开盖，移样本（以前方法），避免污染。
　　结果精确：定性PCR只能定性，很粗略，终点定量PCR由于只能在40个热循环结束后检测荧光，被测荧光达到饱和导致定量不够精确，属于半定量状态。而实时荧光QPCR是在扩增的每时每刻连续检测各样本的荧光值的变化。
应用
　　基因扩增、检测、定量分析； 扩增特异性分析；SNP分析；RFLP多态性分析；单/多基因表达研究；高通量基因表达谱研究。

微基生物其QPCR定量实验流程：
1. 标准曲线的制作
　　标准曲线利用含有qPCR目的片段的质粒为标准基因，具体步骤如下：
　　（1） 选用克隆文库中含有目标基因质粒的摇瓶培养；

根据客户需求，构建标准质粒（16S/18S/ITS/功能基因）

　　（2）试剂盒提取质粒；
　　（3）测定质粒浓度；
　　（4）对质粒的拷贝数进行计算；
　　（5）将质粒DNA进行10倍梯度系列稀释制作标准样品和待测样品一起扩增，得出标准曲线；
　　（6）根据所得标准曲线计算出样品中的基因拷贝数，最后以基因拷贝数每μL为单位进行分析。
2、荧光定量
　　（1）本研究通过荧光定量的方法细菌16S rRNA基因进行定量。引物选取->qPCR。

根据客户需求设计的引物进行实验

　　（2）PCR扩增程序1
3、标准曲线绘制
4、样品中拷贝数测定