根系内生菌样本的采集保存方法

 1 样本的采集

通常采用5点采样法进行取样，采集包含植物根系的整块土壤样本。采用抖土法抖掉与根系松散结合的土壤，然后将于根系紧密结合的土壤刷下来。为了防止微生物死亡或者 DNA 降解，建议采样后将植物根系进行冰冻保存。将根系和根际土放入冰盒（干冰+泡沫盒）中进行低温运输，带回实验室进行处理（为了保证样本在统计学上有意义，每种类型样本至少采集 3 个）。每个根系样本请提供 5~10g。

 2 样本的处理

2.1 超声波清洗法

将根系样本从冰盒取出后，立刻用无菌 PBS 进行第一次冲洗，冲洗后的液体可作为根际微生物样本。之后将根系放入盛有无菌 PBS 的无菌的管子中，用超声波对其进行第二次冲洗，此次冲洗后的液体作为根表微生物样本。之后再把根系放入盛有无菌 PBS 的无菌的新管子中，运用超声波对其进行 2 次冲洗，此次冲洗后的根系为研究根系内生菌的样本。每次超声波使用的频率为 42kHz，30s [1]。

2.2 震荡清洗法

将根系样品放入无菌三角瓶中，加入无菌的 TE 缓冲液，通过摇床震荡将微生物细胞从根系表面释放出来，用玻璃棉对植物悬液进行过滤，收集过滤液。将过滤后的根系放入新的无菌三角瓶中、浸泡在新的无菌 TE 缓冲液中，继续摇床震荡，过滤。反复震荡过 4 次。用第4次洗脱后的根系样品，提取内生菌的DNA。摇床的设定为 350rpm，5min [2,3]。

2.3 表面消毒法

将采集的新鲜植物根系上的杂物用自来水清洗干净，切成小段，吸干水分；称取１g水稻根部组织，用5%次氯酸钠浸泡消毒1min，75%酒精浸泡消毒１min， 再用无菌水清洗 2~3 次至消毒液彻底洗掉，用灭菌滤纸将水分吸干；取最后一次漂洗液涂布于平板以检测表明消毒是否彻底[4]。

 3 样本保存和寄送

将处理好的根系放入灭菌的管子或灭菌的袋子中，放入-80℃冰箱进行低温保存，若条件不允许，可短期（1 个月内）在-20℃冰箱中冷冻保存。注意在样本冻存期间，请勿反复冻融。

送样时请尽量使用冰盒（泡沫盒+干冰+冰袋），以保证运输过程中的低温条件（干冰的挥发消耗量约为 3 公斤/天）。在打包时先放入足量的干冰，之后用冰袋填充泡沫盒中间的空隙，为了保持冰盒中的低温环境，建议采用厚一点的泡沫盒。

 4 参考文献

[1] Joseph Edwards, Cameron Johnson, Christian Santos-Medellin, et al. 2014.
Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. PNAS.

[2] 任改弟. 2013. 水稻叶圈和根圈微生物对大气 CO2 浓度和土壤温度升高的响应.中科院南京土壤所博士论文.

[3] Amanda J. Redford, Noah Fierer. 2009. Bacterial Succession on the Leaf Surface: A Novel System for Studying Successional Dynamics. Plant Microbe interactions.

[4] Barzanti R, Ozino F, Bazzicalupo M, et al. 2007. Isolation and characterization of endophytic bacteria from the nickel hyperaccumulator plant Alyssum bertolonii. Microbial Ecology.